先把蛋白稀釋一定的倍數，比如說10倍、20倍稀釋（這樣可以大體確定一個參數），將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定o.d值，選擇o.d值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個o.d值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清o.d值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的o.d值有明顯差別。
在ELISA試劑盒實驗血清為什么要稀釋？有兩個原因：
1.競爭抑制比較明顯，應稀釋競爭物；
2.血清中含有的性腺激素比較低，應該濃縮才對。
ELISA試劑盒血清標本的保存建議有以下幾點：
1.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。
2.血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，ELISA如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。
3.冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。
4.要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。
5.標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。
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