一個(gè)準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作，三者缺一不可。在操作過(guò)程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問(wèn)題，需要進(jìn)行樣本稀釋。
一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，超過(guò)試劑盒檢測(cè)范圍的，樣本值高的可能情況
1、樣本中待測(cè)物含量過(guò)高。一些高豐度蛋白來(lái)說(shuō)，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。
2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后，大量表達(dá)胰島素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。
4、疫苗原性研究時(shí)，注射疫苗的小鼠，會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)疫苗的抗體。
5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產(chǎn)物，單克隆抗體純品等。
二.在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題：樣本測(cè)定OD值超過(guò)標(biāo)曲最高點(diǎn)OD值，造成測(cè)定數(shù)據(jù)無(wú)法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋，如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)？ 樣本稀釋容易犯的錯(cuò)誤有哪些？
1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏小。
2、過(guò)度稀釋。過(guò)度稀釋時(shí)，容易導(dǎo)致最終結(jié)果偏大。
3、稀釋不夠規(guī)范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范，特別是大比例稀釋時(shí)，人為偏差大大增加。
三、如何確定測(cè)定樣本的稀釋倍數(shù)呢？樣本稀釋的原則如下：在查詢背景知識(shí)，或者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了樣本濃度過(guò)高，需要進(jìn)行稀釋，就要根據(jù)以下原則，嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。
1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測(cè)定的OD值，要求落在標(biāo)準(zhǔn)品最高值OD值的半量程內(nèi)，假定標(biāo)準(zhǔn)品最高值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個(gè)范圍附近，計(jì)算的濃度值最為準(zhǔn)確，以這個(gè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，得到的樣本濃度最準(zhǔn)確。
2、稀釋過(guò)程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋，最好是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行稀釋20倍，得到200倍。
3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過(guò)程中，誤差越大。
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