近期不少客戶向恒遠生物業(yè)務(wù)員抱怨免疫組化中總出現(xiàn)假陽性，很是頭疼。今天小編我特意給您們找來了以往總結(jié)的經(jīng)驗，希望能幫助更多的科研朋友！
1. 消除病理性色素的影響：
當(dāng)所檢動物由于出血等原因造成吞噬含鐵血黃素細胞增多時，為防止其與 DAB 顯色呈現(xiàn)的黃褐色發(fā)生混淆，優(yōu)先選用AEC顯色劑。組織固定時間過長時，切片中容易產(chǎn)生福爾馬林色素顆粒，影響結(jié)果觀察，取材時應(yīng)充分用流水沖洗，以消除影響。
切片制作不當(dāng)引起的非特異性著色 在嚴(yán)重變性、壞死及炎性病灶處，在膠原纖維和結(jié)締組織部位，在切片裱貼不平、折皺處以及組織邊緣部位常會出現(xiàn)非特異性著色。其中有的是因組織荷電狀態(tài)改變而吸附抗體；有的機理不明；有的可能與組織邊緣或皺折深部的槽形構(gòu)型有關(guān)，解決的辦法是在滴加一抗前，以二抗動物的正常血清（ 5 %~10 %）封閉、飽和電荷吸附位點和改善取材與制片技術(shù)。
2. 清洗不充分而造成的非特異性著色：
應(yīng)嚴(yán)格操作規(guī)程。緩沖液中含一定量的鹽，其有利于減低背景著色，通常使用 0.05mlo/L PBS ，溶液內(nèi)加入吐溫 20 ，效果更佳。特殊標(biāo)記時，試劑公司一般都提供緩沖液的配方。另外，在清洗后至加入下一步試劑前，不能干片，干片的部位會出現(xiàn)非特異著色。
DBA顯色產(chǎn)生的某些背景顏色 使用濃縮型 DAB 試劑盒時，請嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸鎦水的 pH 值，以確保實驗結(jié)果的正確性。粉劑 DBA 溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過濾除去。否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點狀著色。另外， DAB 保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將 DAB 保存于避光干燥處，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前加 H2O2。
3. 消除內(nèi)源酶的影響：
在涉及免疫過氧化酶的各種染色中，均用過氧化物酶來標(biāo)記抗體，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，正常組織中也含有一定量的過氧化物酶，其同樣也能催化底物顯色，而影響免疫組化染色的特異性，因此在加入標(biāo)記酶前應(yīng)設(shè)法將其滅活，以保證染色反應(yīng)的特異性。
通常情況下，去除內(nèi)源酶的方法是先用 3%的*溶液作用，但在含有豐富血細胞的標(biāo)本中，由于血細胞中存在大量具有活性的過氧化物酶，能與*產(chǎn)生強烈的反應(yīng)，產(chǎn)生氣泡而破壞組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)。在 OCT 包埋的冰凍切片中，使用 3%的*化溶液亦會產(chǎn)生類似現(xiàn)象。此時可用 3%的*甲醇溶液孵育 20 分鐘的方法滅活內(nèi)源性酶。
滅活內(nèi)源酶對正確判斷含血細胞較多的標(biāo)本，如骨髓、胎盤、脾等的染色結(jié)果十分重要。同樣，正常細胞也含生物素，尤以肝、脾、腎組織含量為多。在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合后繼抗體，形成親和素（或鏈親合素） - 生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽性發(fā)生。消除這種非特異性著色的方法，是在采用生物素方法染色前，對標(biāo)本進行親和素處理，使其結(jié)合位點飽和。
4. 消除非特異性背景著色：
非特異性著色zui常見的情況是蛋白質(zhì)（抗體）吸附到組織切片中高度荷電的膠原及結(jié)締組織成分上，防止非特異性背景著色的方法之一是在滴加一抗前在標(biāo)本上加一種無關(guān)的蛋白質(zhì)溶液，封閉荷電點不給一抗留有吸附余地，以保證一抗不會吸附到膠原纖維及結(jié)締組織成分上。zui常用的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液是所用二抗的同種動物非免疫血清。用產(chǎn)生二抗的同種動物血清，是為了避免二抗與預(yù)先加入的蛋白質(zhì)結(jié)合引起假陽性染色。
用來阻斷非特異性結(jié)合的血清不能有任何溶血現(xiàn)象。紅細胞破裂會使其中的過氧化酶與底物作用，產(chǎn)生非抗原特異性的陽性著色。多克隆抗體因其成分復(fù)雜，更易造成背景染色。稀釋液采用含 1%BAS pH7.4 的 PBS ，同時在洗液中加入 0.05%的吐溫 20 （ Tween20 ）有助于消除背景染色。
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