前言：我們實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)本中大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì),以及蛋白質(zhì)為水溶性，在用于研究之前，常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)凝固，因此在醫(yī)藥上可做檢驗(yàn)時的組織固定劑、以及防腐劑等。而在固定劑中，zui常用的是多聚甲醛。
多聚甲醛染色前固定：
做實(shí)驗(yàn)的過程中，因?yàn)榕挪簧蠈?shí)驗(yàn)儀器、希望標(biāo)本能夠較長時間存放等等原因，很多實(shí)驗(yàn)人員習(xí)慣性都會用4％多聚甲醛預(yù)先固定標(biāo)本。也有為了滅活標(biāo)本里面可能存在的微生物（細(xì)菌、病毒等），起到安全保障作用；或者是做胞內(nèi)染色前的準(zhǔn)備，進(jìn)行固定細(xì)胞。
然而，可能很多人忽視了一點(diǎn)，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標(biāo)本，細(xì)胞表面有些位點(diǎn)在固定后構(gòu)象發(fā)生改變，使得抗體無法結(jié)合產(chǎn)生假陰性，也可能由于固定作用，導(dǎo)致其它位點(diǎn)產(chǎn)生非特異性結(jié)合（假陽性）。
因此，知道哪些抗體染色前不能預(yù)固定，十分重要。
多聚甲醛染色后固定：
染色后的固定，就與抗原構(gòu)象關(guān)系不大了，更多的是熒光素。以前4色以內(nèi)的時候，用的熒光素都是非串聯(lián)的，因此大多數(shù)影響不大，但隨著各種新型串聯(lián)染料的出現(xiàn)，多聚甲醛固定就成了問題了。
事實(shí)上，當(dāng)您去搜索串聯(lián)染色標(biāo)記（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗體時，會發(fā)現(xiàn)一些比較詳細(xì)的描述里面會注明，用多聚甲醛固定過的樣本，必須在4小時內(nèi)檢測，否則容易導(dǎo)致串聯(lián)染料降解，若要長時間保存，還是需要洗滌后，轉(zhuǎn)移到不含多聚甲醛的緩沖液中。
需要注意的是，做GFP熒光檢測的同學(xué)，也需要注意一下，多聚甲醛固定也會影響GFP，多聚甲醛固定后，并非使GFP熒光淬滅，而是使GFP蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，無法產(chǎn)生熒光。有時候您固定后檢測到的熒光可能是自發(fā)熒光，或剩余的未被改變構(gòu)象的GFP發(fā)出的。
解決方案：
1、 如果檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子，請盡量不要預(yù)固定，如需長期保存樣本，可以考慮凍存單個核細(xì)胞。
2、 如果檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛固定保存，但FSC、SSC和熒光強(qiáng)度影響較大。
3、 如果希望在染色后保持較長時間熒光穩(wěn)定，仍建議：避光4度，如果仍不放心，可考慮購買商品化的適用于串聯(lián)染料的固定劑。
點(diǎn)擊交流